[10. 12. 2007 HS 2 Anatomie: Fercher lichtmikroskopie_i-ws06-07.pdf] Strukturuntersuchung unbewaffnetes Auge: >= 0.1 mm - Lichtmikroskop (+UV) > 0.3 um - Elektronenmikroskop > 0.3 nm - MR-Mikroskop > 50 um darunter: Roentgenspektrographie optische Linsen (Brennweite > 0: Sammellinse, < 0: Zerstreuungslinse) f in m Brechkraft B = 1/f (in Dioptrien) Abbildungsgleichung: 1/f=1/b+1/g Vergroesserung: V = B/G=b/g B, G: Bild-, Gegenstandsgroesse b, g: bild-, Gegenstandsweite Erhoehung der Akkomodationstiefe: - Lupe (Sammellinse) Gegenstand in f: Fokussierung im Unendlichen (Parallelstrahlen) -> emmetropes Auge entspannt Lupenvergroesserung (subj. Vergroesserung) Vs=tan(w)/tan(wl) = s0/f Rechenbeispiel: Vergroesserung einer Lupe mit 5 cm -> s0 == 25 cm, V=s0/f=25 cm/5 cm== 5 fach Abbildung nach Lage d. Gegenstandes: g => 2f -> V <= 1 (reelle, verkehrte Abbildung) f < g < 2f (Objektiv): V > 1: reell, verkehrt g < f (Okular): Vs > 1, virtuell, aufrecht - Mikroskop (Aufbau - Tubuslaenge, Objektiv-, Okularvergroesserung) typisch Vobj = 1 - 100 Vok = 6 - 25 Vges = 6 - 2500 (> 2000 kaum sinnvoll) Welleneigenschaften -> begrenzte Aufloesung (Huygens) - Brechung (s. o.) - Beugung (wenn d ~= lambda) Nebenmaxima bei Spaltfoermigen Oeffnungen Beugungsmuster ("Airy-Scheibchen") alpha=asin(1.22*lampda/D) Linsenfassung == Lochblende ... Abbesches Aufloesungsvermoegen delta = 0.61*lambda/A (Apertur) NA, A=n*sin(alpha) -> bei hoeherem Brechungsindex (Immersionsoel) groessere Apertur -> Aufloesung [12. 12. 2007 HS med. Chemie, Schmetterer - 1. Stunde] Mikroskopie - Aufloesung (Auge: begrenzte Zahl von Rezeptoren; geringe Apertur/suboptimales optisches System (chromatische Aberration etc.)) Lupe -> LM (bis 0.3 um) -> EM (bis 0.3 nm) Lichtmikroskop: Lichtquelle -> Kondensor -> Objekt -> Objektiv (reelles, verkehrtes Bild) -> Okular (virtuelles, aufrechtes Bild) gesamt: virtuelles, verkehrtes Bild Begrenzung d. Vergroesserung -> Beugung, Brechung Beugungsmaxima: sin(alpha)=k*lambda/g (k el { ..., -2, -1, 0, 1, 2, ...} Objekt als Gitter -> Beugung Apertur ~ Oeffnungswinkel Kontrasterhoehung: - Faerbung - Dunkelfeld (Ringblende/Spiegelkondensor): nur an Objekt gestreutes Licht gelangt ins Objektiv wichtigste Anwendung: Chromosomenabbildung CAVE: wenig Tiefeninformation, nur Oberflaechen - Phasenkonntrast (Phasen- statt Amplitudeninformation) Phasenverschiebung durch unterschiedliche Brechungsindizes (Dichte) auf Grund der unterschiedlichen Lichtgeschwindigkeiten nicht direkt wahrnehmbar! ~ 1930 Zernike (PN): Phasenverschiebung d. ungebeugten Strahls (Retardierungsplaettchen) -> destruktive Interferenz d. Hauptmaximums FLuoreszenzmikroskopie (Fluoreszenz - waehrend Bestrahlung, Phosphoreszenz - nach Bestrahlung) 19. Jh Stokes ny=c/lambda (Frequenz), h == Plancksches Wirkungsquantum e=h*ny=h*c/lambda Erregerlicht -> Anregung -> bei Abfall auf Zwischenniveau Abstrahlung von Licht geringerer Frequenz/hoeherer Wellenlaenge meist natuerlich im Dunkelfeld (kein Stoerlicht) auch: Auflichtfluoreszenz (Nachteil: schnelles Nachlassen d. Fluoreszenz) - Primaerfluoreszenz (Chlorophyll rot, gruen; Zellwaende blau, gruen, gelb, braun, ... -> weiss) - Sekundaerfluoreszenz (meist Fluorochromierung) Tetracyclin (Knochen, Zaehne, Zellmembranen) Acritinorange (Zellkerne, Zytoplasma, Vakuolen) - Immunfluoreszenz: Antikoerper mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt (klassisch FITC == fluorescine isothiocyanate) -> hochspezifisch Kombination Fluoreszenz, Phasenkontrast, Differentialinterferenz, ... Grundlage: max. Aufloesung d=0.61*lambda/A Elektronenmikroskop Beschleunigungsspannung -> Wellenlaenge: 100 kV: 3.7 pm 1 MeV: 0.88 pm 5 MeV 0.11 pm Ablenkung durch elektrische und magnetische Felder nur kleine Oeffnungswinkel -> geringe Apertur -> d >> lambda (alpha = 35 o, A=~0.006 -> d=0.37 nm) CAVE Kollision mit Luftmolekuelen -> Vakuum! Preis: >= 100 kEUR, gutes Transmissionselektronenmikroskip 300 - 400 kEUR Ausloesung bei ~ 0.5 nm Vorteile EM: - Aufloesung (1000 x LM) - gute Schaerfentiefe - Vergroesserng sehr variabel (Ablenkung ueber E/M-Felder veraenderbar) Nachteil: - Aufwaendige Probenpraeparation (Duennschnitte, Schwermetallfaerbung - keine Lebendpraeparate (Vakuum, Schwermetallfilm, hochenergetische e- ...) neben Transmissionselektronenmikroskop auch Rasterelektronenmikroskop (REM) Oberflaechenabtastung -> fuer massive Proben geeignet Ionisierung d. Oberflaeche (-> Abstrahlung v. Sekundaerelektronen) Zusammensetzung von Helligkeitswerten (cf. Monitor/Fernseher) (~= Reflexion) CAVE Kuehlung des Detektors (N2 liq.) Vorteile REM: - dickere Praeparate - hohe Schaerfentiefe - Vergroesserung variierbar - Mikroanalysemoeglicheiten (-> Zusammensetzung: mehr technische als medizinische Anwendung) Nachteile: - ebenf. Praep. (Metall) - Vakuum - Stickstoffkuehlung -> ebenfalls hohe Kosten 100 - 300 kEUR, Betriebs-, Personalkosten (N2!), keine Lebendstrukturen abbildbar [13. 12. 2007] NMR, -mikroskopie - guter Weichteilkontrast -> Hauptindikation Kontrastierung Bsp Lymphangiom Aufloesung: - Standard (1.5 T) 0.4 mm, - hochaufloesend (3 T) bis 0.2 mm (klinische Verwendung) - B=7T -> 0.1 mm (eher experimentell) Anwendung: in vitro Mikroskopie (Arteriosklerose ...) Beispiel T1, T2-Gewichtung eines Tumors T1: Tumor/gesundes Gewebe T2 gebundenes/nicht gebundenes Wasser (Tumor kaum kontrastiert) T1: korreliert mit Aufenthaltszeit an einem Ort -> Tumor meist hoehere T1-Zeit als umliegendes Gewebe keine gute Fett-, Wasserdifferenzierung (1/T1~=(my**2)*N[ion]/KT -> Temperaturabschaetzung!) 1/T2~=tau (Beweglichkeit, tau[c] == mittlere Beweglichkeit) Kernspins normalerweise zufaellig verteilt (B[ges] = 0) im externen Magnetfeld Praezessionsbewegung (parallel oder antiparallel) Larmor-Praezessionsfrequenz ny abhaengig von - Magnetfeld B - gyromagnetischem Verhaeltnis gamma (abh. v. Element) ny=1/(2*pi)*gamma*B nur bei Elementen mit ungepaarten Protonen im Kern: H-1, C-13, Na-23, P-31 -> vor allem Wasserstoff relevant f. med. NMR Longitudinalrelaxation (Spin-Gitter-Relaxation): Bestrahlung -> Kippen d. Praezessionsachse um 90 o (Y -> X-Achse) Relaxationszeit bis zur Rueckkehr in den Originalzustand -> Abstrahlung FID == free induction decay CAVE: keine ionisierende Strahlung Transversalrelaxation (Spin-Spin-Relaxation): Querrelaxation (Auseinanderdriften) -> Abnahme des Quermagnetfelds Spinenergieaustausch zwischen benachbarten Atomen Spin-Echo Magnetfeld: Permanentmagnet bis max. 0.2 - 0.3 T, -> NMR: supraleitende Magnetspulen (ab 800 kEUR, bis 3 MEUR) Ortskodierung: Magnetfeldgrdienten -> untersch. Larmorfrequenzen Spektroskopie: Frequenzverschiebung (v. a. P-31: Phosphor-Creatinin (PCr), ATP, ADP, NADH) zus. Magnetfeld -> Verschiebung d. Resonanzfrequenz in Abhaengigkeit von chemischen Bindungen (e-, nicht p+!) z. B. Anstieg von Laktat in ischaemischem Hirnareal (Schlaganfall) N-Acetyl-Aspartat-Abnahme (abh. v. Neuronenaktivitaet) [14. 12. 2007] NMR - Molekuelbeweglichkeit Anatomie, Morphologie, Histologie - bis MR-Mikroskopie (exp.) Transport - Blutfluss, Perfusion, Diffusion (-> Ischaemiediagnose) Metabolismus Hirnfunktion - fMRI: neurovasculaere Kopplung (-> Blutfluss) dynamisch: Herzschlag (Entkopplung -> EKG), Peristaltik H2O-Assoziate: - Beweglichkeit temperaturabhaengig - freies Wasser vs. gebundenes Wasser (Ionen/polarisierte Molekuele: Proteine) - Proteine: relativ unbeweglich - Lipide: kleine, relativ bewegliche Molekuele - intrazellulaeres Wasser: gebunden - extrazellulaeres Wasser: frei (Oedeme!) bewegte Wassermolekuele: Blut, Lymphe, Harnwege, Liquor Perfusion/Diffusion Diffusionstechnik: Gradient -> 2 Bilder hintereinander, Verschiebung von Impulsinformation: Bewegungsinformation Perfusionstechnik: Arterie mit spez. MR-Puls beschiessen -> Bildinformation (charakt. Relaxationsfrequenz) aus Kapillarnetz [Boltzmann-theorem: sehr geringer Ueberhang paralleler ueber antiparallele Spins -> Messung nur ueber Abgabe von Radiowellen moeglich] Kontrastmittel: ebenfalls markierbar, -> groessere Areale/mehr Gefaesse gleichzeitig, Endgefaessbett (Auge, ...) Feststellung der Funktionalitaet d. Blut-Hirn-Schranke (kleine Molekuele oder Spezialtransporter) Oedeme: Zusammenbruch -> Fluessigkeitsaustritt aus Gefaessn in Gewebe Schlaganfall - Ischaemie - Ischaemiereperfusionsschaeden: Veraenderung d. Endothels -> Ausschuettung neurotoxischer Substanzen - Abgabe von Neurotoxinen sterbender Neuronen Perfusion/100 g Gewebe: < 20 - schlechte Prognose, 20 - 30 besser, > 30 gute Prognose [17. 12. 2007] Stofftransport und Membranpotentiale (2. VO: Aktionspotentiale) quantitativ: Nernst-, Goldmann-gleichung patch-clamp (Einzelkanalregistrierung) Fluiditaet d. Zellmembran (Lipiddoppelschicht) 6 - 10 nm (Grenze d. EM) Abschirmung Diffusion groessenabhaengig Phospholipide Glykolipide == phosphatfreie Lipide (aussen) Cholesterin (beidseits - regelt Permeabilitaet) Glykokalix: Carrier, Hormonrezeptoren ... Negentropieerhaltung (Zellmembran, ATP-Vermittlung ...) transmembranaler Transport, gerichteter Ionentransport (Potentialaufbau, -aenderung) Transport zw. benachbarten Zellen: - Diffusion (Hormone) - kanalartige Zellverbindungen (Connexone -> Gap Junctions) (Connexon, etym. v. Nexus == Verbindung) - gegenueberliegende Connexone -> Kanal) permeabel fuer Ionen, ATP! -> Ausbreitung d. Erregung zw. Muskelzellen -> Erregungswelle ueber Organ (elektr. Vorgang) bei Abweichen d. intra-/interzellulaeren Konzentrationen -> Isolierung von Zellen passiver Stofftransport (Diffusion): Ausgleich von Konzentrationsgefaellen (brownsche Molekularbewegung) -> kein Energieaufwand, aber Entropiezunahme im Organismus nur ueber kurze Strecken (100 um/5s; 1 cm/14 h) J[diff]=F*D*dC/dx [pharmakologisch: Salben, Augentropfen; cf NSAR/Voltarensalbe: Wirksamkeit?] - Elektrodiffusion Voraussetzung: Membran ionendurchlaessig e- Feld (Quarks) Ionenkanaele Mmebranpotential abh. von. - Leitfaehigkeit elektrische Ladung -> Permeabilitaetskoeffizient X (== P[x]) Umwandlung in Leitfaehigkeit (Ionen) Aktiver Stofftransport (Energieverbrauch) Na+-/K+-ATPase (1 ATP pro 3 Na+ und 2 K+: sehr energieeffizient) -> elektrische Potentialdifferenz Gleichgewichtspotential: Diffusionspotential == elektrisches Potential Nernstsche Gleichung: Delta phi = R*T/(F*z)*ln(c2/c1) Mensch: -91 mV (R=8.31 J*mol^-1*K^-1, T ~= 310 K, F = 96500 C, z = +1 f. K+) Goldmanngleichung (mehrere Ionen): Delta phi = R*T/(z*F)*ln(sum(P[i]*c[i])/sum(P[e]*c[e])) i, e ... K+, Cl-, Na+ intern/extern Patch Clamp: 0.3 - 3 um Glaspipetten -> Spannungsableitung/ -anlegen [18. 12. 2007 Aktionspotential, Leitung] Energieumsatz: Thermodynamik Voraussetzung Potentialdifferenz Umwandlung von Sonnenlicht Gesamtenergiegehalt konstant (0. Hauptsatz d. Thermodynamik) nicht alle Formen umwandelbar Energie Delta U = Q + W (Q Waerme, W Arbeit - positiv oder negativ) Entropie (Unordnung) -> Energieumwandlung nur in Richtung groesserer Unordnung Enthalpie (H), Gibbs Waermefunktion innere Energie + Volumenarbeit Delta H < 0: exotherm Delta H > 0: endotherm 2. Hauptsatz d. Thermodynamik: Unordnung nimmt bei spontan ablaufenden Reaktionen zu (Delta S > 0) Delta S * T = entstehende Waerme Freie Enthalpie: Delta G = Delta H - Delta S * T (-> Intensivmedizin: Steuerung d. Grundumsatzes Grossteil d. Energieumsatzes f. Waermeproduktion aufgewendet) -> Verlust freier Enthalpie -> Entropiezunahme (geschlossenes Gesamtsystem) Homoeostase: Selbstregulation im dyn. Gleichgewicht Energietraeger ATP (Oxidation org. Molekuele) -> lokale Ordnung/Entropieverminderung Aktionspotential: Aenderung d. Membraneigenschaften Muskel- undd Nervenzellen Axon, Dendriten Saeuger: Interaktion durch Neurotransmitter Nichtsaeuger: rein elektrische Leitung an Synapse Messung: Riesenaxon d. Tintenfisches: 1 mm dick, mehrere cm lang Depolarisation: Na+-Leitfaehigkeit steigt an -> Repolarisation: K+-Kanael -> Hyperpolarisation spannungsabhaengige, spannungsunabhaengige Kanaele K+-Kanal: 4 homologe Domaenen, je 6 Segmente: S5, S6: Pore S4 (S2, S3): Spannungssensor nicht spannungsgesteuerte Kanaele: transmittergekoppelt (zus. System) -> Weiterleitung d. Aktionspotentials (kontinuierlich, saltatorisch: zwischen Schnuerringen mit lokaler elektrischer Leitungsgeschwindigkeit, dimensionsmaessig Lichtgeschwindigkeit) -> Nervenleitgeschwindigkeit sehr variabel